国产SUV精品一区二区,国产精品无码一区二区三区免费,一区二区三区国产,少妇精品无码一区二区三区,精品无码一区二区三区爱与,精品国产AV色一区二区深夜久久,强伦人妻一区二区三区视频18,国精产品一区一区三区免费视频,中文字幕一区二区人妻电影,国产精品一区二区在线观看,国产一区二区,国产视频一区二区,一区二区三区视频,亚洲精品一区二区三区四区高清

由于抗生素濫用及過(guò)度使用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥形勢(shì)日益嚴(yán)峻。噬菌體作為感染細(xì)菌的病毒，能夠特異性的殺滅耐藥細(xì)菌，使得噬菌體治療重新進(jìn)入人們的視野。一方面，為了有效評(píng)估噬菌體臨床治療的結(jié)果、揭示微生物群落的復(fù)雜動(dòng)態(tài)，需要精確的方法來(lái)計(jì)數(shù)和檢測(cè)噬菌體顆粒；另一方面，噬菌體計(jì)數(shù)也是生產(chǎn)和開(kāi)發(fā)以噬菌體為基礎(chǔ)的產(chǎn)品、檢測(cè)細(xì)菌感染和食品生物防治所必需的。根據(jù)檢測(cè)對(duì)象的不同（感染性噬菌體、全噬菌體顆粒、核酸和蛋白質(zhì)），本周為大家簡(jiǎn)單介紹一些當(dāng)前主要使用的噬菌體計(jì)數(shù)和檢測(cè)方法。

01   感染性噬菌體檢測(cè)方法

噬菌斑計(jì)數(shù)被認(rèn)為是噬菌體計(jì)數(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)。雙瓊脂覆蓋試驗(yàn)（DLA）允許在含有兩層瓊脂的受限環(huán)境（培養(yǎng)皿）中進(jìn)行局部噬菌體與宿主細(xì)菌的接觸。其中，底層為含有1%-1.5%瓊脂的培養(yǎng)基以支持細(xì)菌生長(zhǎng)，頂層含有相同的培養(yǎng)基，但瓊脂濃度較低（0.4%至0.6%），通常被稱(chēng)為軟瓊脂。將頂層與宿主細(xì)菌混合后倒在底層上，形成所謂的草坪，再將含有噬菌體的樣品添加在頂層，干燥；或者噬菌體和宿主細(xì)菌孵育后與頂層混合，倒在底層上，然后在細(xì)菌生長(zhǎng)的最佳溫度和時(shí)間下培養(yǎng)。如果噬菌體能夠感染被測(cè)細(xì)菌，則草坪上會(huì)出現(xiàn)清晰的斑點(diǎn)或斑塊。單個(gè)菌斑是最初一個(gè)噬菌體裂解一個(gè)宿主細(xì)菌，然后后代噬菌體殺死鄰近細(xì)菌的結(jié)果。噬菌體原種或樣本中感染性噬菌體的濃度（即滴度）可以通過(guò)在草坪上點(diǎn)樣稀釋的樣本來(lái)確定，滴度用菌斑形成單位（PFU，類(lèi)似于菌落形成單位）表示（見(jiàn)圖1）。

02   全噬菌體顆粒檢測(cè)方法

透射電子顯微鏡（TEM）使用電子束產(chǎn)生的分辨率比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡高1000倍，提高分辨率（降到0.2 nm）足以觀察到病毒。盡管樣本高度濃縮（10^6個(gè)顆粒/毫升）才能產(chǎn)生可靠的結(jié)果，但這項(xiàng)技術(shù)可以用來(lái)量化病毒顆粒。用透射電子顯微鏡進(jìn)行病毒定量在確定病毒形態(tài)類(lèi)型和總數(shù)方面具有很高的準(zhǔn)確性，但是當(dāng)運(yùn)行多個(gè)樣品時(shí)，該技術(shù)耗時(shí)、昂貴，而且不能用于復(fù)雜的樣本。此外，樣品的制備也很繁瑣，而且需要熟練的操作人員來(lái)操作復(fù)雜的儀器。

另一種計(jì)數(shù)整個(gè)噬菌體顆粒的技術(shù)是流式細(xì)胞術(shù)。在本項(xiàng)技術(shù)中，病毒顆粒被熒光染料標(biāo)記并被引導(dǎo)通過(guò)毛細(xì)管。毛細(xì)管的直徑小，迫使顆粒以單線流動(dòng)，從而可以檢測(cè)由每個(gè)病毒顆粒引起的光散射。該方法快速且嚴(yán)謹(jǐn)，因此得到了廣泛應(yīng)用。值得注意的是，熒光信號(hào)與基因組大小無(wú)關(guān)，但混合樣本中的不同病毒可以根據(jù)他們的熒光和側(cè)向散射分布區(qū)來(lái)區(qū)分。

由NanoSight Limited公司開(kāi)發(fā)的一種基于激光的方法可以實(shí)時(shí)可視化，基于激光照明光學(xué)顯微鏡的動(dòng)態(tài)光散射在幾分鐘內(nèi)便可以計(jì)數(shù)病毒顆粒。但該技術(shù)需要相對(duì)較高的樣品濃度（10^7-10^9 PFU / ml）和清澈的液體，對(duì)于土壤和糞便等復(fù)雜的樣本很難獲得符合標(biāo)準(zhǔn)的樣品。

03   噬菌體核酸和蛋白質(zhì)檢測(cè)方法

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種簡(jiǎn)單而可靠的方法，它以核酸檢測(cè)為基礎(chǔ)，能比噬菌斑測(cè)定更快地驗(yàn)證噬菌體的存在。通過(guò)應(yīng)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (RAPD) PCR還可以在幾小時(shí)內(nèi)區(qū)分出不同的噬菌體譜系，而不需要進(jìn)行全基因組測(cè)序。然而，由于噬菌體中沒(méi)有普遍存在的標(biāo)志性基因（如細(xì)菌中的16S rRNA基因），因此設(shè)計(jì)針對(duì)整個(gè)噬菌體多樣性的引物很麻煩。PCR的另一個(gè)缺點(diǎn)是結(jié)果不可量化，因?yàn)樵摲磻?yīng)具有終點(diǎn)特征。隨著該領(lǐng)域的進(jìn)步，開(kāi)發(fā)了定量PCR（qPCR）。類(lèi)似地，蛋白質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域也迅速發(fā)展，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS-MS）可用于精確檢測(cè)和計(jì)數(shù)未知樣品中的多肽。

嵌入熒光染料的發(fā)現(xiàn)使人們能夠測(cè)量每個(gè)PCR循環(huán)后聚合的DNA產(chǎn)物的量，即定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）方法。熒光由熱循環(huán)儀記錄，能夠一步擴(kuò)增核酸并檢測(cè)熒光。計(jì)算初始DNA濃度時(shí)，可以將標(biāo)準(zhǔn)用作參考。整個(gè)qPCR平臺(tái)中使用了兩種基本化學(xué)成分：第一種是嵌入熒光DNA染料，第二種是通過(guò)探針、附加的帶有熒光染料和猝滅劑分子的短DNA片段進(jìn)行操作。對(duì)于雙鏈DNA的定量，嵌入染料的使用選擇性比較低，使用熒光標(biāo)記的探針更精確，因?yàn)橹挥性谒腥齻€(gè)DNA片段（正向引物，反向引物和探針）成功雜交并隨后聚合后才能產(chǎn)生信號(hào)，這兩種方法已廣泛用于噬菌體生物學(xué)。

在液滴數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ddPCR）中，將樣品與疏水性物質(zhì)混合形成水油乳狀液，反應(yīng)在每個(gè)液滴中同時(shí)進(jìn)行。將混合物通過(guò)熒光檢測(cè)器來(lái)計(jì)數(shù)在總液滴數(shù)量上發(fā)生放大的液滴數(shù)量。這與樣品中模板DNA的數(shù)量成比例，因此無(wú)需外部標(biāo)準(zhǔn)就可以用于計(jì)算初始濃度。

全基因組測(cè)序（WGS）不需要預(yù)先分離，即可通過(guò)生物信息學(xué)分析對(duì)完整的噬菌體基因組進(jìn)行測(cè)序和組裝。Illumina測(cè)序技術(shù)通常用于識(shí)別新的噬菌體，還可以檢測(cè)來(lái)自不同棲息地的病毒，但是它們并沒(méi)有針對(duì)計(jì)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。一些關(guān)于豐度的信息可能會(huì)被從組裝的重疊群的數(shù)量中提取出來(lái)，從而提供半定量數(shù)據(jù)。但是在重疊群組裝過(guò)程中數(shù)據(jù)的丟失，可能會(huì)導(dǎo)致樣本中噬菌體的數(shù)量被低估。此外，細(xì)菌宿主DNA的攜帶、缺乏參考噬菌體基因組的數(shù)據(jù)庫(kù)以及噬菌體基因組的鑲嵌性質(zhì)使得病毒全基因組測(cè)序作為一種計(jì)數(shù)和檢測(cè)方法具有一定的挑戰(zhàn)性，除非事先知道序列。

04   復(fù)雜樣品中噬菌體的定量

對(duì)復(fù)雜樣本（例如臨床樣本、糞便或食物）中的噬菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)和檢測(cè)，由于可能影響結(jié)果的化學(xué)化合物的存在，需要進(jìn)行特殊處理。如果要從復(fù)雜樣品中定量單個(gè)噬菌體，必須先了解噬菌體及其宿主，以便對(duì)它們的動(dòng)力學(xué)有一個(gè)完整的了解。相反，如果我們的目標(biāo)是量化整個(gè)噬菌體種群，那么我們的挑戰(zhàn)就是去除抑制物。通常，起始的離心步驟會(huì)去除較大的顆粒，然后使用聚四氟乙烯膜過(guò)濾器（孔徑為0.22 mm-0.45 mm）過(guò)濾，濾液中會(huì)富含病毒顆粒。使用聚乙二醇濃縮濾液以獲得高濃度的病毒懸浮液，以進(jìn)行計(jì)數(shù)和檢測(cè)，如使用DLA。此外，基于PCR的方法，在病毒核酸分離之前應(yīng)進(jìn)行物理分離，以最大程度地減少PCR抑制劑的殘留。使用全基因組測(cè)序?qū)?fù)雜樣品中的噬菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，一個(gè)重要步驟是對(duì)讀數(shù)進(jìn)行過(guò)濾，以去除可能干擾后續(xù)分析的非病毒序列?？傊?，在處理復(fù)雜樣品時(shí)，選擇合適的預(yù)處理方法、下游方法對(duì)獲得關(guān)于噬菌體濃度的綜合結(jié)果很重要。

近年來(lái)，隨著噬菌體在臨床上治療細(xì)菌感染、在食品中進(jìn)行生物控制的廣泛應(yīng)用，使得對(duì)在復(fù)雜樣品中進(jìn)行噬菌體計(jì)數(shù)和檢測(cè)的方法的需求越來(lái)越大。最廣泛使用的選擇是DLA方法，因?yàn)樗跍y(cè)定感染性噬菌體計(jì)數(shù)方面具有快速、廉價(jià)和準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，幾種分子生物學(xué)技術(shù)提高了速度和可重復(fù)性，但是這些方法不能區(qū)分感染和缺陷的病毒顆粒，因此得出的結(jié)果很難與傳統(tǒng)的DLA空斑分析進(jìn)行比較。分子和噬菌體生物學(xué)的改進(jìn)可以將當(dāng)前使用的計(jì)數(shù)和檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，而這將有助于開(kāi)發(fā)新的計(jì)數(shù)和檢測(cè)方法。