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自1928年發(fā)現(xiàn)并在1940年代開發(fā)用于臨床以來，抗生素已經(jīng)挽救了數(shù)百萬人的生命，并在無數(shù)重要的醫(yī)療程序中根深蒂固。然而，正是由于臨床上抗生素的過度使用，抗菌藥物耐藥性在全球范圍內(nèi)日漸增長，并且嚴(yán)重危及臨床治療效果。

目前抗生素開發(fā)的局限性威脅到治療細(xì)菌感染的長期能力。在過去的20年中，只有少數(shù)幾類新的抗生素被發(fā)現(xiàn)并被批準(zhǔn)用于臨床試驗(yàn)。這是由于中小型企業(yè)通常采用基于現(xiàn)有分子化學(xué)修飾的傳統(tǒng)研發(fā)策略進(jìn)行抗菌開發(fā)。此外，目前抗生素的臨床研發(fā)管道主要集中在已知抗生素的組合上，因此只有有限數(shù)量的抗菌靶標(biāo)正在被開發(fā)[1]。大多數(shù)抗生素對(duì)各種細(xì)菌具有廣譜活性，如果使用不當(dāng)不僅會(huì)加劇耐藥性的發(fā)展，還會(huì)對(duì)共生細(xì)菌如腸道微生物產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，迫切需要加速開發(fā)新的抗菌藥物，找到不易產(chǎn)生耐藥性并以更具體的方式發(fā)揮作用的新型抗菌靶點(diǎn)。

來自比利時(shí)基因技術(shù)實(shí)驗(yàn)室的研究人員在current opinion in biotechnology期刊上發(fā)表了一篇題為“Phage-based target discovery and its exploitation towards novel antibacterial molecules”的論文。在這篇綜述中，作者提出了一種綜合的噬菌體驅(qū)動(dòng)策略，即通過噬菌體-細(xì)菌的相互作用來揭示新的抗菌靶點(diǎn)。這種策略將能夠設(shè)計(jì)出模擬抑制性噬菌體蛋白的小分子，并允許隨后開發(fā)這些抗菌化合物。不同于噬菌體療法和基于噬菌體酶的抗微生物劑，這種方法可能產(chǎn)生更可持續(xù)的新一代新抗生素，這些抗生素利用新的細(xì)菌靶標(biāo)并以病原體特異性方式起作用[2]。

噬菌體和細(xì)菌之間的相互作用是由它們緊密交織的共同進(jìn)化歷史驅(qū)動(dòng)的。在整個(gè)進(jìn)化過程中，噬菌體在裂解感染周期中不斷適應(yīng)以在軍備競(jìng)賽中對(duì)抗它們的細(xì)菌宿主。噬菌體使用復(fù)雜的分子機(jī)制來劫持細(xì)菌細(xì)胞代謝以產(chǎn)生后代病毒顆粒。這種密切的關(guān)系導(dǎo)致了高度特異性和進(jìn)化優(yōu)化的分子相互作用的出現(xiàn)，因此代表了識(shí)別新的潛在抗菌靶點(diǎn)的獨(dú)特來源。

隨著高通量基因組測(cè)序的進(jìn)步，研究者已經(jīng)對(duì)數(shù)以萬計(jì)的噬菌體基因組進(jìn)行了測(cè)序。噬菌體基因組大小從2.3kb到735kb不等，它們編碼精確的信息以改變宿主細(xì)菌中的DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞分裂和蛋白質(zhì)翻譯途徑。然而，由于與已知蛋白質(zhì)缺乏同源性以及實(shí)驗(yàn)證據(jù)的滯后，大約一半到三分之二的噬菌體基因產(chǎn)物僅被注釋為功能未知的假設(shè)蛋白質(zhì)。這些假設(shè)蛋白質(zhì)中的大多數(shù)在噬菌體感染的早期階段表達(dá)，表明它們?cè)谒拗鞔x中具有重要作用。研究這些噬菌體假設(shè)蛋白的功能，尤其是那些對(duì)宿主生長有不利影響的蛋白質(zhì)，不僅可以為噬菌體生物學(xué)提供更詳細(xì)的見解，而且更重要的是或許還能增加對(duì)噬菌體感染過程中細(xì)菌重編程的了解[3,4]。

受噬菌體啟發(fā)的抗菌靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)

從噬菌體研究中揭示新的細(xì)菌靶點(diǎn)可以激發(fā)新型小分子化合物的篩選和設(shè)計(jì)，這些化合物模擬了噬菌體蛋白的生長抑制作用。2004年噬菌體衍生的抗菌靶點(diǎn)首次被發(fā)現(xiàn)。研究人員從26個(gè)金黃色葡萄球菌噬菌體的基因組中發(fā)現(xiàn)31個(gè)多肽家族對(duì)宿主表現(xiàn)出毒性[5]。其中一種基因產(chǎn)物是來自金黃色葡萄球菌噬菌體77的ORF104，它與宿主DNA復(fù)制中的一種必需蛋白質(zhì)解旋酶裝載物 (DnaI) 相互作用。作為一個(gè)新的靶點(diǎn)，DnaI和ORF104之間的相互作用隨后被用于時(shí)間分辨熒光(TR-FRET) 以篩選小分子抑制劑。最后，在125000個(gè)經(jīng)過篩選的小分子中，有36個(gè)可以中斷DnaI和ORF104之間的分子相互作用，其中11個(gè)在合理的MIC (≤16 mg/ml)下對(duì)金黃色葡萄球菌具有直接活性。

盡管這種針對(duì)噬菌體蛋白及小分子盲篩的方法是從金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)的，其原理啟發(fā)了其他研究者從噬菌體中尋找新的分子靶標(biāo)。除革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌外，該篩查技術(shù)已應(yīng)用于馬紅球菌、恥垢分枝桿菌以及包括大腸桿菌、銅綠假單胞菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和肺炎克雷伯菌在內(nèi)的一些革蘭氏陰性病原體。作者在本項(xiàng)研究中，想要擴(kuò)展這種基于噬菌體的原始靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)策略，以更全面的方式識(shí)別和利用新的抗菌靶標(biāo)進(jìn)行藥物發(fā)現(xiàn)。該策略由兩種互補(bǔ)方法驅(qū)動(dòng)：一是“噬菌體基因組驅(qū)動(dòng)篩選”，即從已知的有毒噬菌體蛋白開始，引導(dǎo)發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)；二是 “細(xì)菌靶點(diǎn)驅(qū)動(dòng)篩選”，即以識(shí)別針對(duì)已知假定細(xì)菌靶標(biāo)的噬菌體編碼抑制劑。在確認(rèn)這些相互作用后，這些方法趨向于設(shè)計(jì)或篩選用于臨床前開發(fā)的小模擬分子（圖1）。

噬菌體基因組驅(qū)動(dòng)篩選

由于噬菌體基因組注釋中假設(shè)蛋白質(zhì)非常豐富，因此在功能未知的“早期”假設(shè)蛋白質(zhì)中尋找具有新靶點(diǎn)的殺菌多肽是合理的。從噬菌體基因組中篩選單個(gè)假設(shè)基因是一個(gè)耗時(shí)且費(fèi)力的過程。因此，仔細(xì)選擇測(cè)試池可以減少工作量并最大限度地提高鑒定抗菌噬菌體蛋白的效率。除了消除編碼已知功能的蛋白質(zhì)（包括結(jié)構(gòu)蛋白）和具有預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的基因外，關(guān)注小基因和早期基因顯著降低了噬菌體基因篩選的工作量。事實(shí)上，大多數(shù)報(bào)道的噬菌體-宿主相互作用發(fā)生在感染的早期階段，并且涉及小的噬菌體蛋白（250個(gè)氨基酸）。或者，可以使用具有隨機(jī)噬菌體基因組片段而不是單個(gè)基因的文庫，從而跳過單個(gè)基因克隆的繁瑣步驟。

為了檢測(cè)假設(shè)的噬菌體蛋白引起的生長抑制，需要使用高通量方法來縮短篩選過程，因此作者開發(fā)了一種基于高通量測(cè)序的篩選方法。在用LC-MS/MS消除噬菌體顆粒相關(guān)蛋白后，所有“真實(shí)”假設(shè)的噬菌體基因片段都連接到高拷貝載體pU11L4上，使用 Illumina HiSeq進(jìn)行轉(zhuǎn)化和測(cè)序。由于“有毒”基因產(chǎn)物不會(huì)為細(xì)胞產(chǎn)生可行的重組質(zhì)粒，因此基于這些有毒基因座的測(cè)序深度降低的負(fù)選擇是可能的。實(shí)際上，可以從這些區(qū)域以低序列覆蓋深度精確定位殺菌多肽（圖2）。此外，由于窄譜靶標(biāo)將是未來抗菌治療的首選，所以應(yīng)在多個(gè)宿主中測(cè)試已鑒定的抗菌噬菌體蛋白，以確定細(xì)菌靶標(biāo)的毒性和保護(hù)范圍。

一旦鑒定出抗菌噬菌體蛋白，它們就可以作為發(fā)現(xiàn)抗菌靶標(biāo)的誘餌。這種細(xì)菌相互作用伙伴的識(shí)別仍然是一個(gè)關(guān)鍵問題。為此，可以使用不同的技術(shù)，包括質(zhì)譜分析、酵母雙雜交和基于基因組的篩選，重點(diǎn)是通過刪除或過表達(dá)目標(biāo)蛋白來消除毒性。迄今為止，最有希望的候選蛋白質(zhì)包括那些影響宿主復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞分裂的蛋白質(zhì)。

細(xì)菌靶向驅(qū)動(dòng)篩選以鑒定噬菌體編碼的抑制劑

與篩選過程從大規(guī)模基因組挖掘開始的噬菌體基因組驅(qū)動(dòng)篩選方法不同，靶向驅(qū)動(dòng)篩選使用宿主細(xì)胞中定義的必需蛋白質(zhì)復(fù)合物作為誘餌，從噬菌體中剔除未知的相互作用伙伴。在Van den Bossche等人的早期研究中，選擇參與銅綠假單胞菌代謝的必需蛋白質(zhì)復(fù)合物作為誘餌，包括用于轉(zhuǎn)錄和基因組復(fù)制的RpoA、DnaN，用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控的MvaT、Hfq，用于細(xì)胞分裂的FtsZ，用于脂肪酸生物合成的AcpP和用于能量維持的GlcB[6]。含有這些標(biāo)記蛋白復(fù)合物的突變菌株被噬菌體感染后進(jìn)行質(zhì)譜分析，在該分析中確定了37個(gè)噬菌體相互作用伙伴，其中8個(gè)直接影響細(xì)菌生長。其他研究人員也使用類似方法從銅綠假單胞菌噬菌體中鑒定出一些與宿主生長、代謝相關(guān)的重要蛋白質(zhì)。

模仿噬菌體蛋白的生長抑制作用 

被噬菌體多肽選擇性抑制的細(xì)菌蛋白可能成為新的抗菌靶點(diǎn)，因?yàn)樗鼈円坏┍黄茐暮罂赡軙?huì)影響一些基本過程并導(dǎo)致細(xì)菌生長遲緩。通過對(duì)抗菌機(jī)制的進(jìn)一步表征以及相互作用位點(diǎn)的規(guī)范，以建立一種有效的方法來識(shí)別模擬噬菌體蛋白抗菌作用的小分子或抗菌肽。此外，實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)與結(jié)構(gòu)和生物物理分析以及相互作用建模相結(jié)合，以能夠直接設(shè)計(jì)針對(duì)已識(shí)別靶標(biāo)的有效抑制劑。

研究人員使用高分辨率X射線晶體學(xué)、核磁共振和低溫電子顯微鏡已經(jīng)確定了少數(shù)靶向假定抗菌靶標(biāo)的噬菌體蛋白的結(jié)構(gòu)。例如，通過冷凍電鏡對(duì)來自大腸桿菌噬菌體1的Gam和來自T7的Orc/Gp0.3的兩種不同蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者都模仿DNA，并可能被用于開發(fā)DNA結(jié)合蛋白抑制劑[7]。同樣，通過X射線晶體學(xué)發(fā)現(xiàn)噬菌體phiKZ的Dip蛋白與RNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，這可能會(huì)激發(fā)RNA轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑的發(fā)現(xiàn)。使用核磁共振發(fā)現(xiàn)來自大腸桿菌噬菌體T7的Gp2蛋白被證明可以改變RNA聚合酶的構(gòu)象，從而限制ssDNA進(jìn)入活性位點(diǎn)，這種失活代表了另一種使細(xì)菌RNA聚合酶失活的機(jī)制[8]。除了設(shè)計(jì)適合活性位點(diǎn)口袋的小分子外，計(jì)算機(jī)模擬方法還能夠優(yōu)化化合物，提高它們的活性并計(jì)算它們的物理化學(xué)性質(zhì)，從而增加成功通過后續(xù)臨床前階段的機(jī)會(huì)。

結(jié)論與展望  

作為細(xì)菌病原體的“捕食者”，毒性噬菌體在對(duì)抗抗生素耐藥性發(fā)展的斗爭中展現(xiàn)出巨大的潛力。大多數(shù)噬菌體只能感染一個(gè)物種內(nèi)非常有限的細(xì)菌分離株，這種特異性源于長期的細(xì)菌-噬菌體進(jìn)化。除了將噬菌體顆粒應(yīng)用于感染部位的噬菌體療法或溶素等基于酶的抗菌劑外，深入了解噬菌體劫持機(jī)制可以通過新的作用方式或設(shè)計(jì)新藥發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有抗菌藥物的許多新靶點(diǎn)。值得注意的是，由于必須有特定的遺傳工具以及跨學(xué)科技術(shù)較難整合等問題存在，所以這一研究領(lǐng)域在向其他新興病原體擴(kuò)展時(shí)仍面臨挑戰(zhàn)。然而，考慮到這些進(jìn)化優(yōu)化相互作用的高價(jià)值，與當(dāng)前小分子篩選的隨機(jī)性相比，這條擴(kuò)展的研發(fā)管線可能值得實(shí)施。

最近出現(xiàn)的利用噬菌體的策略已經(jīng)超越了它們最初的抗菌特性，轉(zhuǎn)向了其他替代方法。除了直接殺死宿主外，還可以在噬菌體研究中探索抗毒劑。用這些化合物進(jìn)行預(yù)處理可能會(huì)降低病原體的毒力，使這些細(xì)菌更容易被吞噬細(xì)胞吞噬和血清殺傷。由此，人體免疫系統(tǒng)成為噬菌體和細(xì)菌戰(zhàn)場(chǎng)上必不可少的第三方。這個(gè)關(guān)鍵三角形成為開發(fā)可持續(xù)抗菌藥物和了解人類與微生物組之間生物和進(jìn)化動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵。  

參考文獻(xiàn)

1.Tyers, M. and G.D. Wright, Drug combinations: a strategy to extend the life of antibiotics in the 21st century. Nat Rev Microbiol, 2019. 17(3): p. 141-155.

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4.Li, T., et al., Isolation and Characterization of the Novel Phage JD032 and Global Transcriptomic Response during JD032 Infection of Clostridioides difficile Ribotype 078. mSystems, 2020. 5(3).

5.Yu, X., et al., Characterization and genomic study of "phiKMV-Like" phage PAXYB1 infecting Pseudomonas aeruginosa. Sci Rep, 2017. 7(1): p. 13068.

6.Van den Bossche, A., et al., Systematic identification of hypothetical bacteriophage proteins targeting key protein complexes of Pseudomonas aeruginosa. J Proteome Res, 2014. 13(10): p. 4446-56.

7.Wilkinson, M., et al., Structural basis for the inhibition of RecBCD by Gam and its synergistic antibacterial effect with quinolones. Elife, 2016. 5.

8.Sheppard, C., et al., A non-bacterial transcription factor inhibits bacterial transcription by a multipronged mechanism. RNA Biol, 2013. 10(4): p. 495-501.